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l'autorizzazione per l'uso di emergenza dalla Food and Drug Administration statunitense3,4.In modelli animali, remdesivir si è dimostrato efficace contro l'infezione da coronavirus della sindrome respiratoria mediorientale (MERS-CoV) e coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV)2,5,6.In vitro, remdesivir ha inibito la replicazione di SARS-CoV-27,8.Qui indaghiamo l'efficacia di remdesivir in un modello di macaco rhesus dell'infezione da SARS-CoV-29.A differenza degli animali trattati con veicoli, i macachi trattati con remdesivir non hanno mostrato segni di malattie respiratorie;hanno anche mostrato infiltrati polmonari ridotti alle radiografie e titoli virali ridotti nei lavaggi broncoalveolari dodici ore dopo la prima dose.La diffusione del virus dal tratto respiratorio superiore non è stata ridotta dal trattamento con remdesivir.All'autopsia, gli animali trattati con remdesivir avevano una carica virale polmonare inferiore e un danno polmonare ridotto.Pertanto, il trattamento con remdesivir iniziato precocemente durante l'infezione ha avuto un beneficio clinico nei macachi rhesus infettati da SARS-CoV-2.Sebbene il modello del macaco rhesus non rappresenti la grave malattia osservata in alcuni pazienti con COVID-19, i nostri dati supportano l'inizio precoce del trattamento con remdesivir nei pazienti con COVID-19 per prevenire la progressione verso la polmonite.Abbiamo recentemente stabilito un modello di macaco rhesus dell'infezione da SARS-CoV-29.In questo modello, i macachi rhesus infetti sviluppano una malattia respiratoria transitoria da lieve a moderata, con infiltrati polmonari visibili sulle radiografie e un pattern di spargimento simile a quello osservato nei pazienti con COVID-19.I segni clinici osservati e le elevate cariche virali consentono di testare l'efficacia del trattamento degli antivirali ad azione diretta in questo modello.Due gruppi di sei macachi rhesus sono stati inoculati con il ceppo SARS-CoV-2 nCoV-WA1-2020.Dodici ore dopo l'inoculazione, a un gruppo sono stati somministrati 10 mg kg-1 di remdesivir per via endovenosa e l'altro gruppo è stato trattato con un volume uguale di soluzione veicolo (2 ml kg-1).Il trattamento è stato continuato 12 ore dopo il primo trattamento e successivamente ogni 24 ore con una dose di 5 mg kg-1 di remdesivir o un volume uguale di soluzione veicolo (1 ml kg-1).La concentrazione di remdesivir è stata determinata nel siero raccolto 12 ore dopo il trattamento iniziale e 24 ore dopo le dosi successive (immediatamente prima della somministrazione della dose successiva di trattamento).Remdesivir (profarmaco GS-5734), il suo metabolita a valle dell'alanina (GS-704277) e il nucleoside genitore (GS-441524) sono stati rilevati nel siero di tutti gli animali trattati con remdesivir (dati estesi Fig. 1a).I livelli sierici del profarmaco e dei metaboliti a valle erano coerenti con i livelli plasmatici precedentemente pubblicati di questi composti in macachi rhesus sani, che hanno mostrato una breve emivita sistemica per GS-5734 (0,39 h) con conseguente conversione transitoria al GS-704277 intermedio e persistenza del prodotto GS-441524 a valle a livelli plasmatici più elevati10.Le concentrazioni del metabolita GS-441524 sono state misurate nel tessuto polmonare raccolto da ciascun lobo polmonare sette giorni dopo l'inoculazione (dpi) e 24 ore dopo la somministrazione dell'ultima dose di remdesivir;il metabolita era facilmente rilevabile in tutti gli animali trattati con remdesivir.GS-441524 era generalmente distribuito in tutti e sei i lobi del polmone (dati estesi Fig. 1b).GS-704277 non è stato rilevato nel tessuto polmonare.Sebbene il metabolita farmacologicamente attivo di remdesivir sia il trifosfato di GS-441524, i campioni di omogenato polmonare addizionati con il metabolita trifosfato hanno dimostrato un rapido decadimento del metabolita in questa matrice (dati non mostrati).I livelli di GS-441524 sono stati presi come surrogato per il caricamento dei tessuti e suggeriscono che l'attuale strategia di dosaggio ha consegnato i metaboliti dei farmaci ai siti di replicazione di SARS-CoV-2 negli animali infetti.Dopo l'inoculazione con SARS-CoV-2, agli animali è stato assegnato un punteggio clinico giornaliero basato su un foglio di punteggio prestabilito in modo cieco.Dodici ore dopo la prima somministrazione di remdesivir, i punteggi clinici negli animali trattati con remdesivir erano significativamente inferiori rispetto agli animali di controllo che ricevevano la soluzione del veicolo.Questa differenza nel punteggio clinico è stata mantenuta per tutto lo studio (Fig. 1a).Solo uno dei sei animali trattati con remdesivir ha mostrato una lieve dispnea, mentre tachipnea e dispnea sono state osservate in tutti i controlli trattati con il veicolo (Tabella 1 dei dati estesi).Gli infiltrati polmonari radiografici sono uno dei segni distintivi di COVID-19 nell'uomo.Le radiografie eseguite a 0, 1, 3, 5 e 7 dpi hanno mostrato un coinvolgimento del lobo polmonare significativamente inferiore e un'infiltrazione polmonare meno grave negli animali trattati con remdesivir rispetto a quelli trattati con il veicolo (Fig. 1b, c).a, Punteggi clinici giornalieri per animali infetti da SARS-CoV-2 e trattati con remdesivir (cerchi rossi, n = 6) o soluzione del veicolo (quadrati neri, n = 6).b, Punteggi radiografici cumulativi.Le radiografie ventrodorsali e laterali sono state valutate per la presenza di infiltrati polmonari da un veterinario clinico secondo un sistema di punteggio standard (0, normale; 1, infiltrati polmonari interstiziali lievi; 2, infiltrati polmonari moderati forse con cancellazione parziale del bordo cardiaco e piccole aree polmonari consolidamento; 3, infiltrati interstiziali gravi, ampie aree di consolidamento polmonare, pattern alveolari e broncogrammi aerei).Sono stati valutati i singoli lobi e sono stati sommati e visualizzati i punteggi per animale al giorno.c, radiografie ventrodorsali per ogni animale preso a 7 dpi.Le aree di infiltrazione polmonare sono cerchiate.L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un'ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Sidak.A 1, 3 e 7 dpi, è stato eseguito il lavaggio broncoalveolare (BAL) come indicatore della replicazione del virus nel tratto respiratorio inferiore.Sebbene le cariche virali in BAL fossero ridotte negli animali trattati con remdesivir, questa differenza non era statisticamente significativa (Fig. 2a).Tuttavia, 12 ore dopo la somministrazione del primo trattamento con remdesivir, il titolo del virus infettivo nel BAL era circa 100 volte inferiore negli animali trattati con remdesivir rispetto ai controlli.Di 3 dpi, il virus infettivo non poteva più essere rilevato in BAL da animali trattati con remdesivir, mentre il virus era ancora rilevato in BAL da quattro su sei animali di controllo (Fig. 2b).Nonostante questa riduzione della replicazione del virus nel tratto respiratorio inferiore, non vi è stata riduzione della carica virale o del titolo del virus infettivo nei tamponi nasali, della gola o del retto raccolti da animali trattati con remdesivir, fatta eccezione per una differenza significativa nel titolo del virus nei tamponi della gola raccolti su 1 dpi e nelle cariche virali nei tamponi faringei raccolti su 4 dpi (Dati estesi Fig. 2).a, b, Carichi virali (a) e titoli di virus infettivi in ​​BAL (b) raccolti da macachi rhesus infetti da SARS-CoV-2 e trattati con remdesivir (n = 6) o soluzione veicolo (n = 6).TCID50, dose infettiva di coltura tissutale 50%.L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un'ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Sidak.c, Carichi virali nei tessuti raccolti da tutti e sei i lobi polmonari all'autopsia su 7 dpi da macachi rhesus infettati da SARS-CoV-2 e trattati con remdesivir (n = 6) o soluzione del veicolo (n = 6).L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un test t spaiato.Barre centrali, mediana.Tutti gli animali sono stati sottoposti a eutanasia a 7 dpi.Campioni di tessuto sono stati raccolti da ciascun lobo polmonare per confrontare la replicazione del virus tra gli animali trattati con remdesivir e quelli trattati con il veicolo.In 10 su 36 campioni di lobi polmonari raccolti da animali trattati con remdesivir, non è stato possibile rilevare l'RNA virale, mentre questo era il caso solo in 3 su 36 lobi polmonari raccolti da animali di controllo.In generale, il confronto tra i singoli lobi polmonari nei due gruppi ha mostrato una media geometrica inferiore dell'RNA virale nel gruppo trattato con remdesivir (dati estesi Fig. 3a).Insieme, questi dati mostrano che la carica virale era significativamente più bassa nei polmoni degli animali trattati con remdesivir rispetto a quelli dei controlli trattati con il veicolo (Fig. 2c).Il virus potrebbe essere isolato dai lobi polmonari di cinque su sei animali di controllo trattati con il veicolo, ma non da nessuno dei tessuti polmonari raccolti dagli animali trattati con remdesivir.Sebbene la PCR quantitativa con trascrizione inversa (qRT-PCR) abbia mostrato che un minor numero di tessuti da altre posizioni nel tratto respiratorio era positivo per l'RNA virale negli animali trattati con remdesivir rispetto ai controlli, queste differenze non erano statisticamente significative (Dati estesi Fig. 3b).All'autopsia a 7 dpi, i polmoni sono stati valutati grossolanamente per le lesioni.Lesioni polmonari grossolane sono state osservate in uno su sei animali trattati con remdesivir.Al contrario, tutti e sei gli animali di controllo trattati con il veicolo presentavano lesioni visibili, risultando in una differenza statisticamente significativa nell'area dei polmoni interessata dalle lesioni (Fig. 3a, b, Dati estesi Fig. 4a, b).Questa differenza era evidente anche quando si calcolava il rapporto peso-corporeo polmonare come indicatore di polmonite;questo rapporto era significativamente inferiore negli animali trattati con remdesivir rispetto agli animali trattati con veicolo (dati estesi Fig. 4c).Istologicamente, gli animali trattati con remdesivir presentavano lesioni meno gravi rispetto ai controlli trattati con il veicolo.Lesioni polmonari istologiche erano assenti in tre su sei animali trattati con remdesivir;i tre animali rimanenti hanno sviluppato una patologia polmonare minima.Le lesioni in questi animali sono state caratterizzate come polmonite interstiziale ampiamente separata, minima, spesso localizzata negli spazi subpleurici (Fig. 3c, e).Cinque su sei animali trattati con veicolo hanno sviluppato polmonite interstiziale multifocale, da lieve a moderata (Fig. 3d, f).Abbiamo rilevato l'antigene virale in un piccolo numero di pneumociti di tipo I e di tipo II e macrofagi alveolari in tutti gli animali, indipendentemente dal trattamento (Fig. 3g, h).I macachi Rhesus infettati da SARS-CoV-2 e trattati con remdesivir (a sinistra, n = 6) o con la soluzione del veicolo (a destra, n = 6) sono stati sottoposti a eutanasia a 7 dpi.a, b, Viste dorsali rappresentative dei polmoni da un animale trattato con remdesivir (a) e un animale trattato con veicolo con aree di consolidamento focalmente estese (b, cerchi).L'analisi istologica è stata eseguita su tre sezioni di sei lobi polmonari di ciascuno dei sei animali per gruppo di trattamento e sono state scelte immagini rappresentative per c-h.c, Polmonite interstiziale subpleurica minima (riquadro) osservata in tre su sei animali trattati con remdesivir.d, Polmonite interstiziale subpleurica moderata con edema (riquadro) osservata in cinque dei sei animali trattati con il veicolo.e, Area inscatolata da c con alveoli rivestiti da pneumociti di tipo II (freccia) e spazi alveolari contenenti macrofagi schiumosi (punta di freccia).f, Area inscatolata da d con interstizio polmonare espanso da edema e un numero moderato di macrofagi e neutrofili.Gli alveoli sono rivestiti da pneumociti di tipo II (frecce).Gli spazi alveolari sono pieni di edema (asterisco) e un piccolo numero di macrofagi polmonari (punta di freccia).g, antigene virale in pneumociti di tipo I (freccia) e pneumociti di tipo II (punta di freccia) di un animale trattato con remdesivir.h, Antigene virale in pneumociti di tipo I (freccia) e macrofagi (punta di freccia) di un animale trattato con veicolo.Barre di scala: c, d, 200 μm;e–h, 20 micron.Abbiamo eseguito con successo il sequenziamento profondo su campioni di tutti gli animali trattati con remdesivir e controlli trattati con veicolo.Mutazioni note nella RNA polimerasi RNA-dipendente che conferiscono resistenza al remdesivir nei coronavirus11 non sono state rilevate in nessuno dei campioni testati (Tabella Supplementare 1).Remdesivir è, a nostra conoscenza, il primo trattamento antivirale a dimostrare l'efficacia provata contro SARS-CoV-2 in un modello animale di COVID-19.Il trattamento dei macachi rhesus infettati da SARS-CoV-2 con remdesivir ha ridotto la malattia clinica e il danno ai polmoni.Il dosaggio di remdesivir utilizzato nei macachi rhesus è equivalente a quello utilizzato negli esseri umani;tuttavia, a causa della natura acuta della malattia nei macachi rhesus, è difficile tradurre direttamente i tempi del trattamento utilizzato nei corrispondenti stadi della malattia nell'uomo.Nel nostro studio, il trattamento è stato somministrato vicino al picco di replicazione del virus nei polmoni, come indicato dalla carica virale nei lavaggi broncoalveolari e i primi effetti del trattamento sui segni clinici e sulla replicazione del virus sono stati osservati entro 12 ore.L'efficacia degli antivirali ad azione diretta contro le infezioni virali acute del tratto respiratorio diminuisce tipicamente con i ritardi nell'inizio del trattamento12.Pertanto, il trattamento con remdesivir deve essere iniziato il prima possibile nei pazienti con COVID-19 per ottenere il massimo effetto del trattamento.Nonostante la mancanza di segni respiratori evidenti e la ridotta replicazione del virus nei polmoni degli animali trattati con remdesivir, non vi è stata alcuna riduzione della diffusione del virus.Questo risultato è molto importante per la gestione del paziente, dove un miglioramento clinico non deve essere interpretato come una mancanza di infettività.Sebbene abbiamo dimostrato che i metaboliti di remdesivir si trovano nel tratto respiratorio inferiore, i livelli di farmaco nel tratto respiratorio superiore non sono stati caratterizzati e dovrebbero essere prese in considerazione nuove formulazioni con vie alternative di somministrazione del farmaco per migliorare la distribuzione al tratto respiratorio superiore, riducendo così lo spargimento e il potenziale rischio di trasmissione.Tuttavia, poiché la grave malattia da COVID-19 deriva da un'infezione virale dei polmoni, questo organo è l'obiettivo principale del trattamento con remdesivir.La biodisponibilità e l'effetto protettivo di remdesivir nei polmoni dei macachi rhesus infetti supportano il trattamento dei pazienti COVID-19 con remdesivir.Il trattamento con remdesivir non ha comportato un miglioramento clinico in uno studio clinico con pazienti con COVID-1913 grave;tuttavia, un altro studio clinico che ha coinvolto più pazienti ha mostrato che il trattamento con remdesivir ha comportato un tempo di miglioramento più breve rispetto ai pazienti che hanno ricevuto solo cure standard14.I nostri risultati nei macachi rhesus indicano che il trattamento con remdesivir dovrebbe essere considerato il prima clinicamente possibile per prevenire la progressione alla polmonite nei pazienti con COVID-19.Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dei Rocky Mountain Laboratories, NIH e condotti da personale certificato in una struttura accreditata a livello internazionale dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio (AAALAC), secondo le linee guida dell'istituto per uso degli animali, seguendo le linee guida e i principi di base della Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, l'Animal Welfare Act, il Dipartimento dell'agricoltura degli Stati Uniti e la politica del servizio sanitario pubblico degli Stati Uniti sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio.I macachi Rhesus sono stati alloggiati in gabbie di primati individuali adiacenti, consentendo interazioni sociali, in una stanza climatizzata con un ciclo luce-buio fisso (12 ore di luce-12 ore di buio).Gli animali sono stati monitorati almeno due volte al giorno durante l'esperimento.Due volte al giorno venivano forniti cibo commerciale per scimmie, dolcetti e frutta da personale addestrato.L'acqua era disponibile ad libitum.L'arricchimento ambientale consisteva in una varietà di interazioni umane, manipolazioni, giocattoli commerciali, video e musica.Il comitato istituzionale per la biosicurezza (IBC) ha approvato il lavoro con ceppi infettivi di SARS-CoV-2 in condizioni BSL3.L'inattivazione del campione è stata eseguita secondo le procedure operative standard approvate dall'IBC per la rimozione dei campioni dall'alto contenimento.Per valutare l'effetto del trattamento con remdesivir sull'esito della malattia da SARS-CoV-2, abbiamo utilizzato il modello di macaco rhesus recentemente stabilito dell'infezione da SARS-CoV-2 che provoca una malattia transitoria del tratto respiratorio inferiore9.Poiché si tratta di un modello con pochi dati preliminari, non è stato possibile eseguire un'analisi della potenza per determinare la dimensione del gruppo.La dimensione del campione era quindi basata sull'esperienza con altri modelli di primati non umani di malattie respiratorie, principalmente un modello di macaco rhesus di MERS-CoV dove n = 6 ha prodotto una significatività statistica.Dodici animali sono stati assegnati in modo casuale a due gruppi e inoculati come descritto in precedenza con una dose totale di 2,6 × 106 TCID50 (50% di dose infettiva di coltura tissutale) di ceppo SARS-CoV-2 nCoV-WA1-2020 per via intranasale, orale, oculare e intratracheale itinerari.L'efficacia del trattamento terapeutico con remdesivir è stata testata in due gruppi di sei macachi rhesus adulti (tre maschi e tre femmine ciascuno; 3,6–5,7 kg).A causa della natura acuta del modello SARS-CoV-2 nei macachi rhesus, il trattamento terapeutico è stato avviato 12 ore dopo l'inoculazione con SARS-CoV-2 e continuato una volta al giorno per 6 dpi.Un gruppo di macachi rhesus è stato trattato con una dose di carico di 10 mg/kg di remdesivir, seguita da una dose di mantenimento giornaliera di 5 mg/kg.L'altro gruppo di sei animali è servito come controllo infetto e gli è stato somministrato un volume di dose uguale (cioè 2 ml/kg di dose di carico e successivamente 1 ml/kg) di soluzione veicolo (12% di sulfobutiletere-β-ciclodestrina in acqua e acido cloridrico , pH 3,5) secondo lo stesso schema di trattamento.Questo schema di dosaggio nei macachi rhesus imita il dosaggio giornaliero testato negli studi clinici che coinvolgono pazienti con COVID-19 e si traduce in un'esposizione sistemica simile al farmaco.Il trattamento è stato somministrato come iniezione endovenosa in bolo (dose totale erogata in circa 5 minuti) somministrata alternativamente nelle vene cefaliche o safeniche sinistra o destra.Sebbene il corso di trattamento con remdesivir utilizzato qui nei macachi rhesus sia più breve del corso standard di 10 giorni nei pazienti, questo corso di trattamento più breve è stato scelto per consentire la valutazione della patologia polmonare in un momento successivo all'inoculazione in cui sarebbero ancora presenti infiltrati polmonari e polmonite interstiziale.Dati recenti provenienti da studi clinici hanno dimostrato che un ciclo di trattamento di 5 giorni ha un beneficio clinico simile a un corso di trattamento di 10 giorni nei pazienti con COVID-1914.Gli animali sono stati osservati due volte al giorno per segni clinici di malattia utilizzando un foglio di punteggio standardizzato come descritto in precedenza9;la stessa persona, che era in cieco per l'assegnazione di gruppo degli animali, ha valutato gli animali durante lo studio.L'endpoint predeterminato per questo esperimento era 7 dpi.Durante la somministrazione del trattamento sono stati raccolti quotidianamente tamponi nasali, faringei e rettali.Gli esami clinici sono stati eseguiti su 0, 1, 3, 5 e 7 dpi su animali anestetizzati.Nei giorni dell'esame sono stati raccolti parametri clinici come peso corporeo, temperatura, pulsossimetria, pressione sanguigna e frequenza respiratoria, nonché radiografie del torace dorsoventrale e laterale.Le radiografie sono state analizzate da un veterinario clinico in cieco rispetto all'assegnazione di gruppo degli animali.A 1, 3 e 7 dpi è stato eseguito un BAL utilizzando 10 ml di soluzione fisiologica sterile.Dopo la morte a 7 dpi, sono state eseguite autopsie sugli animali.La percentuale di lesioni polmonari macroscopiche è stata valutata da un patologo veterinario certificato in cieco all'assegnazione di gruppo degli animali e sono stati raccolti campioni dei seguenti tessuti: linfonodo cervicale, congiuntiva, mucosa nasale, orofaringe, tonsilla, trachea, tutti i lobi polmonari , linfonodo mediastinico, bronco destro e sinistro, cuore, fegato, milza, reni, stomaco, duodeno, digiuno, ileo, cieco, colon e vescica urinaria.L'analisi istopatologica dei vetrini dei tessuti è stata eseguita da un patologo veterinario certificato, in cieco rispetto all'assegnazione di gruppo degli animali.L'isolato SARS-CoV-2 nCoV-WA1-2020 (MN985325.1)15 (Vero passaggio 3) è stato gentilmente fornito dai Centers for Disease Control (CDC) e propagato una volta nelle cellule Vero E6 nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM, Sigma ) integrato con siero bovino fetale al 2% (Gibco), 1 mM l-glutamina (Gibco), 50 U/ml di penicillina e 50 μg/ml di streptomicina (Gibco) (mezzo di isolamento del virus).Lo stock di virus utilizzato era identico al 100% alla sequenza GenBank depositata iniziale (MN985325.1) e non sono stati rilevati contaminanti.Le cellule VeroE6 sono state mantenute in DMEM integrate con siero di vitello fetale al 10%, 1 mM l -glutamina, 50 U/ml di penicillina e 50 μg/ml di streptomicina.Remdesivir (RDV; GS-5734) è stato prodotto presso Gilead Sciences dal Department of Process Chemistry (Alberta, Canada) in condizioni di Good Manufacturing Practice (GMP).Il lotto numero 5734-BC-1P è stato solubilizzato in 12% di solfobutiletere-β-ciclodestrina in acqua e la soluzione del veicolo corrispondente è stata fornita a NIH.La tributilamina è stata acquistata da Millipore Sigma.Acqua di grado LC-MS, acetone, metanolo, isopropanolo e acido acetico sono stati acquistati tramite Fisher Scientific.Tutti gli standard sintetici per l'analisi molecolare sono stati forniti da Gilead Sciences Inc. Il siero e gli omogenati polmonari eliminati sono stati irradiati con raggi gamma (2 MRad) per inattivare il virus infettivo potenzialmente presente in questi campioni prima dell'analisi.I campioni sono stati preparati per l'analisi di piccole molecole diluendo un'aliquota di 50 μl di siero o di omogenato polmonare chiarificato con 950 μl di acetone al 50%, metanolo al 35%, acqua al 15% (v/v) su ghiaccio.I campioni sono stati incubati a temperatura ambiente per 15 minuti e quindi centrifugati a 16.000 g per 5 minuti.I supernatanti chiarificati (850 μl) sono stati recuperati e portati a secco in un concentratore Savant DNA120 SpeedVac (Thermo Fisher).I campioni sono stati risospesi in 100 μl di metanolo al 50%, acqua al 50% (v/v) e centrifugati come prima.Il supernatante è stato portato in una fiala campione per l'analisi LC-MS.I campioni sono stati separati utilizzando una strategia di cromatografia liquida ad accoppiamento ionico su un sistema Sciex ExionLC AC.I campioni sono stati iniettati su una colonna Waters Atlantis T3 (100 Å, 3 μm, 3 mm × 100 mm) ed eluiti utilizzando un gradiente binario da 5 mM di tributilamina, 5 mM di acido acetico in 2% isopropanolo, 5% metanolo, 93% acqua ( v/v) al 100% di isopropanolo in 5,5 min.Gli analiti sono stati misurati utilizzando uno spettrometro di massa Sciex 5500 QTRAP in modalità negativa.Il monitoraggio della reazione multipla è stato eseguito utilizzando due coppie di segnali per ciascun analita e la fedeltà del segnale è stata confermata raccogliendo spettri di ioni prodotto innescati e confrontandoli con gli spettri di standard sinteticamente puri.Tutti gli analiti sono stati quantificati rispetto a una curva di calibrazione a otto punti del rispettivo standard sintetico preparato nella matrice target (ovvero siero o omogenato polmonare eliminato) ed elaborati allo stesso modo dei campioni sperimentali.Il limite di quantificazione (LOQ) è stato approssimato a un segnale al rumore di 10. I LOQ per le molecole misurate in ciascuna matrice erano 5 nM per GS-441524 sia nell'omogenato polmonare che nel siero, 1 nM per GS-704277 sia nell'omogeneizzato polmonare che siero e 0,08 nM per GS-5734 nel siero.L'instabilità di GS-5734 e del metabolita nucleotidico trifosforilato nell'omogenato polmonare durante la lisi tissutale ha impedito il rilevamento di questi metaboliti nel tessuto polmonare.L'RNA è stato estratto dai tamponi e dal BAL utilizzando il kit QiaAmp Viral RNA (Qiagen) secondo le istruzioni del produttore.I tessuti (30 mg) sono stati omogeneizzati in tampone RLT e l'RNA è stato estratto utilizzando il kit RNeasy (Qiagen) secondo le istruzioni del produttore.Per il rilevamento dell'RNA virale, 5 μl di RNA sono stati utilizzati in un saggio RT-PCR E in tempo reale in una fase16 utilizzando il kit sonda Rotor-Gene (Qiagen) secondo le istruzioni del produttore.In ciascuna corsa, sono state eseguite in parallelo diluizioni standard di standard di RNA conteggiati mediante PCR digitale a goccia, per calcolare il numero di copie nei campioni.Le titolazioni del virus sono state eseguite mediante titolazione end-point in cellule Vero E6.Il tessuto è stato omogeneizzato in 1 ml di DMEM utilizzando un TissueLyser (Qiagen).Le cellule sono state inoculate con diluizioni seriali di dieci volte di campioni di tampone e BAL.L'isolamento del virus è stato eseguito sui tessuti polmonari omogeneizzando il tessuto in 1 ml di DMEM e inoculando cellule Vero E6 in una piastra da 24 pozzetti con 250 μl di omogenato eliminato e una diluizione 1:10 dello stesso.Un'ora dopo l'inoculazione delle cellule, l'inoculo è stato rimosso e sostituito con 100 μl (titolazione del virus) o 500 μl di mezzo di isolamento del virus.Sei giorni dopo l'inoculazione, è stato valutato il CPE ed è stato calcolato il TCID50.L'istopatologia e l'immunoistochimica sono state eseguite su tessuti di macaco rhesus.Dopo la fissazione per un minimo di 7 giorni in formalina tamponata neutra al 10% e l'inclusione in paraffina, le sezioni di tessuto sono state colorate con ematossilina ed eosina (H&E).Per rilevare l'antigene SARS-CoV-2, l'immunoistochimica è stata eseguita utilizzando un antisiero di coniglio su misura contro SARS-CoV-2 N a una diluizione 1:1.000.I vetrini colorati sono stati analizzati da un patologo veterinario certificato.L'RNA virale è stato estratto come descritto sopra.I cDNA sono stati preparati come descritto, con modifiche minori17.In breve, 3-12 μl di RNA estratto sono stati impoveriti di rRNA utilizzando Ribo-Zero Gold H/M/R (Illumina) e quindi trascritti inversa utilizzando esameri casuali e SuperScript IV (ThermoFisher Scientific).Dopo il trattamento con RNaseH, la sintesi del secondo filamento è stata eseguita utilizzando il frammento di Klenow (New England Biolabs) e i cDNA a doppio filamento risultanti sono stati trattati con una miscela combinata di RiboShredder RNase Blend (Lucigen) e RNase, DNase-free, high conc (Roche Diagnostics, Indianapolis , IN) e quindi purificato utilizzando la purificazione con microsfere Ampure XP (Beckman Coulter).Il kit di preparazione della libreria HyperPlus di Kapa (Roche Sequencing Solutions) è stato utilizzato per preparare le librerie di sequenziamento dai cDNA a doppio filamento.Per facilitare il multiplexing, la legatura dell'adattatore è stata eseguita con KAPA Unique Dual-Indexed Adapters e i campioni sono stati arricchiti per il prodotto legato con l'adattatore utilizzando la miscela KAPA HiFi HotStart Ready e sette cicli di amplificazione PCR, secondo il manuale del produttore.Pool costituiti da otto librerie di campioni sono stati utilizzati per l'arricchimento del virus con acquisizione ibrida utilizzando il pannello myBaits Expert Virus SARS-CoV-2 e seguendo il manuale del produttore, versione 4.01, con 14 cicli di amplificazione PCR post-acquisizione (Arbor Biosciences).Le librerie purificate e arricchite sono state quantificate utilizzando il kit di quantificazione della libreria Kapa (Roche Sequencing Solutions) e sequenziate come letture di 2 × 150 coppie di basi sullo strumento Illumina NextSeq 550 (Illumina).Le letture grezze fastq sono state tagliate delle sequenze dell'adattatore Illumina utilizzando cutadapt versione 1.1218 e quindi tagliate e filtrate per la qualità utilizzando FASTX-Toolkit (Hannon Lab).Le letture rimanenti sono state mappate sul genoma SARS-CoV-2 2019-nCoV/USA-WA1/2020 (MN985325.1) utilizzando Bowtie2 versione 2.2.919 con parametri --local --no-mixed -X 1500. I duplicati PCR sono stati rimossi utilizzando picard MarkDuplicates (Broad Institute) e le varianti sono state chiamate utilizzando GATK HaplotypeCaller versione 4.1.2.020 con parametro -ploidy 2. Le varianti sono state filtrate per QUAL >1000 e DP >20 utilizzando bcftools.Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software GraphPad Prism versione 8.2.1.Ulteriori informazioni sulla progettazione della ricerca sono disponibili nel Nature Research Reporting Summary collegato a questo documento.Tutti i dati inclusi in questo manoscritto sono stati depositati a Figshare (https://doi.org/10.35092/yhjc.12111570).Le sequenze sono state depositate in NCBI con il numero di accesso a BioProject PRJNA632475.Lo, MK et al.GS-5734 e il suo analogo nucleosidico genitore inibiscono Filo-, Pneumo- e Paramyxovirus.Sci.Rep. 7, 43395 (2017).ADS PubMed PubMed Central Articolo Google ScholarShehan, TP et al.L'antivirale ad ampio spettro GS-5734 inibisce sia i coronavirus epidemici che quelli zoonotici.Sci.trad.Med.9, eaal3653 (2017).PubMed PubMed Central Articolo Google ScholarUS National Library of Medicine Clinical Trials.gov (visitato il 15 maggio 2020);https://clinicaltrials.gov/ct2/results?cond=&term=remdesivir&cntry=&state=&city=&dist=Food and Drug Administration statunitense.Aggiornamento sul coronavirus (COVID-19): la FDA rilascia l'autorizzazione all'uso di emergenza per un potenziale trattamento COVID-19 https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-issues-emergency -autorizzazione-uso-potenziale-trattamento-covid-19 (2020).de Wit, E. et al.Trattamento profilattico e terapeutico con remdesivir (GS-5734) nel modello di macaco rhesus dell'infezione da MERS-CoV.Proc.Natl Acad.Sci.USA 117, 6771–6776 (2020).Articolo PubMed PubMed Central Google ScholarShehan, TP et al.Efficacia terapeutica comparativa di remdesivir e combinazione di lopinavir, ritonavir e interferone beta contro MERS-CoV.Nat.Comune.11, 222 (2020).ADS CAS PubMed PubMed Central Articolo Google ScholarChoy, KT et al.Remdesivir, lopinavir, emetina e omoharringtonina inibiscono la replicazione di SARS-CoV-2 in vitro.Ris. antivirale178, 104786 (2020).CAS PubMed PubMed Central Articolo Google ScholarWang, M. et al.Remdesivir e clorochina inibiscono efficacemente il nuovo coronavirus (2019-nCoV) recentemente emerso in vitro.Ris. cella30, 269–271 (2020).CAS PubMed PubMed Central Articolo Google ScholarMunster, VJ et al.Malattia respiratoria nei macachi rhesus inoculati con SARS-CoV-2.Natura https://doi.org/10.1038/s41586-020-2324-7 (2020).Warren, TK et al.Efficacia terapeutica della piccola molecola GS-5734 contro il virus Ebola nelle scimmie rhesus.Natura 531, 381–385 (2016).ADS CAS PubMed PubMed Central Articolo Google ScholarAgostino, ML et al.La suscettibilità al coronavirus al remdesivir antivirale (GS-5734) è mediata dalla polimerasi virale e dall'esoribonucleasi di correzione di bozze.MBio 9, e00221-18 (2018).CAS PubMed PubMed Central Articolo Google ScholarShehan, TP et al.Un antivirale ad ampio spettro biodisponibile per via orale inibisce SARS-CoV-2 nelle colture di cellule epiteliali delle vie aeree umane e più coronavirus nei topi.Sci.trad.Med.12, eabb5883 (2020).CAS PubMed Articolo Google ScholarWang, Y. et al.Remdesivir negli adulti con COVID-19 grave: uno studio multicentrico randomizzato, in doppio cieco, controllato con placebo.Lancetta 395, 1569–1578 (2020).CAS PubMed PubMed Central Articolo Google ScholarScheda informativa per gli operatori sanitari Autorizzazione all'uso di emergenza (EUA) di Veklury (remdesivir) https://www.gilead.com/-/media/files/pdfs/remdesivir/eua-fact-sheet-for-hcps_01may2020.pdf (Gilead Scienze, 2020).Harcourt, J. et al.Sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 da paziente con malattia da coronavirus, Stati Uniti.emergereInfettare.Dis.26, 1266–1273 (2020).CAS PubMed PubMed Central Articolo Google ScholarCorman, VM et al.Rilevamento del nuovo coronavirus del 2019 (2019-nCoV) mediante RT-PCR in tempo reale.Sorveglianza Euro.25, 2000045 (2020).Briese, T. et al.Il sequenziamento dell'acquisizione del virome consente una diagnosi virale sensibile e un'analisi completa del viroma.MBio 6, e01491-15 (2015).CAS PubMed PubMed Central Articolo Google ScholarMartin M. 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Mora per la preparazione dei dati;Puoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarNota dell'editore Springer Nature rimane neutrale per quanto riguarda le rivendicazioni giurisdizionali nelle mappe pubblicate e le affiliazioni istituzionali.Chiunque condivida il seguente link potrà leggere questo contenuto:Spiacenti, un link condivisibile non è attualmente disponibile per questo articolo.Fornito dall'iniziativa di condivisione dei contenuti Springer Nature SharedItInviando un commento accetti di rispettare i nostri Termini e Linee guida della community.Se trovi qualcosa di offensivo o non conforme ai nostri termini o linee guida, segnalalo come inappropriato.Iscriviti alla newsletter di Nature Briefing: ciò che conta nella scienza, gratuitamente nella tua casella di posta ogni giorno.